在藥品的微生物污染控制體系中，**是極其重要的一個(gè)組成部分。**工藝的選擇、開發(fā)、驗(yàn)證、監(jiān)控等整個(gè)生命周期中，離不開生物指示劑的使用，只有物理殺滅和生物殺滅效果均達(dá)到預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)，**工藝方可用于產(chǎn)品或組件的**。關(guān)于生物指示劑的使用，行業(yè)內(nèi)一直存在諸多疑問，本文分兩部分對(duì)生物指示劑進(jìn)行詳細(xì)的介紹，**部分重點(diǎn)介紹理論基礎(chǔ)，包括**動(dòng)力學(xué)（F0值、D值等概念和計(jì)算）、**法的選擇和監(jiān)控、物理殺滅和生物殺滅的一致性和驗(yàn)證等內(nèi)容；**部分重點(diǎn)介紹生物指示劑的種類、包裝形式、選擇、使用和質(zhì)量控制等內(nèi)容。
生物指示劑(Biological Indicators)，根據(jù)ISO11138的定義 - test system containing viable microorganisms providing a defined resistance to a specified sterilization process，即含有活的微生物的測(cè)試系統(tǒng)，其為特定的**工藝提供確定的抵抗力。2015年版《中國(guó)藥典》四部1421**法的定義為“生物指示劑系一類特殊的活微生物制品，可用于確認(rèn)**設(shè)備的性能、**程序的驗(yàn)證、生產(chǎn)過程**效果的監(jiān)控等?！睆亩x可以看出，生物指示劑是一類含有活的微生物的測(cè)試系統(tǒng)，其主要用于**工藝的驗(yàn)證或監(jiān)控。
生物指示劑是用于**工藝，在介紹其之前，我們需要了解**的原理，以便理解生物指示劑的特性、使用和質(zhì)量控制。
一、**原理
所謂**，即“用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段將物品中活的微生物殺滅或除去，從而使物品殘存活微生物的概率下降至預(yù)期的無菌保證水平的方法。（2015年版《中國(guó)藥典》）”**主要有殺滅和除去兩種方式，前者是通過物理或者化學(xué)的手段殺滅產(chǎn)品中的微生物，后者則是通過一定的分離機(jī)制（目前主要是過濾的方式）將微生物從產(chǎn)品中分離。這兩種方式的機(jī)理不同、動(dòng)力學(xué)不同，其適合的模型也不同。本文所闡述的主要是前者，即殺滅的方式去除微生物。
當(dāng)前制藥工業(yè)所用的**方式很多，包括熱力學(xué)**，如濕熱**，如蒸汽**、過熱水**；干熱**；輻照**，如γ射線**、X射線**、電子束**；氣體**，如環(huán)氧乙烷**、氣態(tài)過氧化氫**、甲醛**、臭氧**等。這些**方式的**介質(zhì)不同，殺滅微生物的機(jī)理也不同，相應(yīng)的工藝開發(fā)、工藝控制和工業(yè)驗(yàn)證也不盡相同。但是，除了輻照**外，從**模型的研究、**工藝的驗(yàn)證和生物指示劑的選擇和使用來看，這些**方式都有共通之處。因此，本文以研究*為深入的濕熱**為例，詳細(xì)介紹**動(dòng)力學(xué)和**驗(yàn)證，從而深入了解生物指示劑在其中的作用。
濕熱**主要是通過高溫使得微生物的蛋白質(zhì)、核酸等分子發(fā)生變性，從而殺滅微生物。這個(gè)過程與很多因素有關(guān)，如**溫度、**時(shí)間、微生物的種類和數(shù)量、微生物所處的環(huán)境、蒸汽質(zhì)量等等。為研究**的動(dòng)力學(xué)，我們把微生物的數(shù)量（N）對(duì)**時(shí)間（t）作曲線，關(guān)系如下：
這一曲線關(guān)系不利于**的研究，如果把微生物的數(shù)量用對(duì)數(shù)值進(jìn)行處理（lgN），再對(duì)時(shí)間（t）作曲線，則會(huì)得到以下的曲線
這里我們可以看到，兩者（微生物數(shù)量對(duì)數(shù)值lgN和**時(shí)間t）成直線關(guān)系。這一轉(zhuǎn)換大大方便了**動(dòng)力學(xué)的研究，也構(gòu)成了整個(gè)濕熱**模型的基礎(chǔ)?；诖四Ｐ停覀兞私庖韵聨讉€(gè)重要的參數(shù)：
? 微生物的耐熱性，D值的概念：
自然界的微生物種類多種多樣，不同微生物的耐熱性是不一樣的，反映在**曲線（lgN~t）上，耐熱性弱的微生物lgN隨著時(shí)間下降較快，而耐熱性強(qiáng)的微生物lgN隨溫度下降的速度慢。這一點(diǎn)*直接的反映便是直線的斜率（k），如果直線的斜率（**值，如下圖）越大，微生物lgN下降越快，耐熱性越低，反之亦然
雖然斜率k值可以反應(yīng)這一關(guān)系，但是為了便于理解和日常運(yùn)用，我們?cè)谛甭蔾的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)簡(jiǎn)單的變換，引入D值的概念。令D=?1/k=△t/△lgN，即，D值可以理解為微生物數(shù)量下降一定的對(duì)數(shù)值所需要的時(shí)間。當(dāng)△lgN為1時(shí)，所需要的**時(shí)間恰好等于D值，故D值定義為使微生物下降一個(gè)對(duì)數(shù)值所需要的**時(shí)間。因微生物數(shù)量下降一個(gè)對(duì)數(shù)值與殺滅90%的意義相同，故D值又稱之為90%殺滅時(shí)間。這樣的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)換，使得D值的定義易于理解，在**工藝中也方便應(yīng)用，這一點(diǎn)在后面的介紹中會(huì)得到體現(xiàn)。
D值的影響因素很多，包括（但不限于）：
-
生物的種類和形式，一般芽孢桿菌以芽孢的形式存在時(shí)，耐熱性強(qiáng)，D值大；
-
微生物所處的形式（對(duì)于生物指示劑而言，即為生物指示劑的載體，如紙載式、不銹鋼片、液體等）；
-
包裝形式；
-
溶液種類（對(duì)于處于液體中的微生物而言）；
-
**的溫度。
有了D值，便可以對(duì)**后的微生物數(shù)量進(jìn)行計(jì)算。初始污染菌數(shù)為N0表示，**后的污染菌數(shù)用NF表示，某一溫度下的D值用DT表示，**時(shí)間用t表示，則：
(lgN0–lgNF) = t/DT ，也即lgNF =lgN0 –t/DT
假定某一物品初始污染菌數(shù)N0 為106，某一溫度T下的D值為2.5min，則：
***1分鐘后，lgNF= lgN0–t/DT = 6–1/2.5 = 5.6
* **2分鐘后，lgNF= lgN0–t/DT = 6–2/2.5 = 5.2
這里可以看到，隨著**時(shí)間t的無限增加，lgNF變得無窮小，但NF是始終大于0的，也就是說，**的無菌（NF為0）理論上來說是不存在的。在制藥行業(yè)中，NF為10-6，也就百萬分之一便是終端**產(chǎn)品可以接受的無菌保證（概率）水平。因此，在這個(gè)案例中，如果要達(dá)到百萬分之一的無菌保證水平，所需要的**時(shí)間為：
-6 = 6–t/2.5， 即**時(shí)間t需要30分鐘。
? 微生物的耐熱性（D值）與溫度的關(guān)系，Z值的概念
引入D的模型只考慮了同一溫度下的**曲線，即**過程中溫度沒有波動(dòng)時(shí)微生物數(shù)量lgN與**時(shí)間t之間的關(guān)系。事實(shí)上，產(chǎn)品**時(shí)是無法將**溫度控制在某一恒定溫度的。而D值，即微生物的耐熱性，是與溫度直接相關(guān)的，溫度越高，D值越小，溫度越低，D值越大。如果要研究產(chǎn)品的**過程，我們就需要找到D值與溫度的關(guān)系。
這里，我們測(cè)定同一微生物在不同**溫度下的D值（測(cè)試方法將在本專題的**部分介紹），把微生物的D值的對(duì)數(shù)值lgD（縱坐標(biāo)）與產(chǎn)品的溫度T（橫坐標(biāo)）作曲線，會(huì)得到以下直線關(guān)系：
這里可以看出，lgD與**溫度T是成直線關(guān)系的（模型與lgN~t相同）。通過直線可以看出，lgD與T的負(fù)相關(guān)性與我們研究D值的來源正好相同。同樣，為了便于理解和日常運(yùn)用，我們也不直接用斜率k來反應(yīng)這樣的關(guān)系，而是引入Z值的概念；同樣，令Z=?1/k=△T/△lgD，當(dāng)lgD等于1時(shí)，所需要提高的溫度△T恰好等于Z值。因此，Z值的定義即為Ｄ值下降一個(gè)對(duì)數(shù)值所需要提高的溫度。
研究表明，大部分的微生物Ｚ值均在10 ℃左右（濕熱**），因此，在無特殊說明的情況下，為簡(jiǎn)化計(jì)算，Ｚ值均默認(rèn)為10 ℃。
? 不同溫度下**時(shí)間的換算，等效**時(shí)間FTref的概念
**工藝雖然有溫度波動(dòng)，但是有了Z值的概念，我們便可以將不同溫度下的等效**時(shí)間通過D值進(jìn)行換算。將不同溫度下得**時(shí)間用FTT表示，要換算120 ℃下的**時(shí)間，等效于121 ℃下的**時(shí)間，可根據(jù)lgN~T的關(guān)系曲線：
F121 = D121×△lgN
F120 = D120×△lgN
所謂等效**時(shí)間，即**效果相同所需要的**時(shí)間，因此兩者的△lgN相等。兩等式相除，得到：
這個(gè)公式需要我們考察D值與溫度的關(guān)系，這恰好是Z值的概念。根據(jù)考察Z值時(shí)D值與溫度的關(guān)系，我們得到：
故，120 ℃**1分鐘，其相當(dāng)于在121 ℃下的**時(shí)間為0.79分鐘。
同理，我們可以計(jì)算出**過程中任何溫度（T）下的**時(shí)間（FT）相當(dāng)于其在121 ℃下的等效**時(shí)間（F121），即：
F121 = FT×10(T-121)/Z
同樣，我們也可以將**過程中的任何溫度（T）下的**時(shí)間（FT）換算為其在任何參考溫度Tref下的等效**時(shí)間（FTref），即：
FTref = FT×10(T-Tref)/Z
? **工藝的**能力，F0值的概念
如果我們把所有的**工藝都統(tǒng)一換算為同一溫度下的**時(shí)間，則不同**工藝的**能力便有了可比性，也可以針對(duì)**能力制定量化的標(biāo)準(zhǔn)，這一參考溫度便是121.1℃。如果把**過程中每一時(shí)刻的**時(shí)間都換算為121.1℃的**時(shí)間，再進(jìn)行累積，得到整個(gè)**過程在121.1℃下的**時(shí)間，這一時(shí)間便是F0值（ISO17665，Z值定義為10℃）。
二、**工藝的**能力要求
前面我們介紹過，產(chǎn)品的無菌保證水平（SAL）為10-6。而**工藝要達(dá)到這樣的SAL，所需要的**能力取決于**前的微生物負(fù)載（**前的微生物數(shù)量）和微生物負(fù)載的耐熱性。制藥行業(yè)一般都有嚴(yán)格的微生物污染控制措施，**前的微生物負(fù)載（N0）一般不會(huì)超過1066，故106便認(rèn)為是微生物負(fù)載的*差條件；自然界中很少會(huì)發(fā)現(xiàn)D121℃大于0.5分鐘的微生物，故D121℃值為1分鐘，便認(rèn)為微生物負(fù)載耐熱性的*差條件。
F0 = D121℃×(lgN0-lgNt）= 1×(6-(-6)) = 12分鐘
備注：EMA要求不低于15分鐘。
此時(shí)，由于微生物負(fù)載的數(shù)量和耐熱性都取*差條件，日常**時(shí)，對(duì)于二者的監(jiān)控不是必須的。
F0= D121℃×(lgN0-lgNt) = 1×(2-(-6)) = 8分鐘
這也是GMP規(guī)定F0值一般不低于８分鐘的原因。此時(shí)，微生物負(fù)載的數(shù)量 不是取的*差條件，日常**時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控；而耐熱性取*差條件， 故對(duì)耐熱性的監(jiān)控不是必須的。
F0= D121℃×(lgN0-lgNt) = 0.4×(2-(-6)) = 3.2分鐘
此時(shí)，微生物負(fù)載的數(shù)量和耐熱性都不是取*差條件，日常**時(shí)需要對(duì)兩者同時(shí)進(jìn)行監(jiān)控。
三、**工藝驗(yàn)證中的生物指示劑
根據(jù)2010年版GMP的要求，“第六十三條 任何**工藝在投入使用前，必須采用物理檢測(cè)手段和生物指示劑，驗(yàn)證其對(duì)產(chǎn)品或物品的適用性及所有部位達(dá)到了**效果。”因此，在驗(yàn)證某一**工藝時(shí)，不僅僅要采用物理的檢測(cè)手段（對(duì)于濕熱**而言，主要是溫度，還包括壓力、蒸汽質(zhì)量等），還需要采用生物指示劑進(jìn)行檢測(cè)，以確保**工藝達(dá)到預(yù)期的**效果。單純的物理測(cè)試，一方面其檢測(cè)的參數(shù)有限，不能反應(yīng)所有的影響因素對(duì)于**工藝的影響。常見的濕熱**，主要檢測(cè)的參數(shù)為溫度和壓力，但是，蒸汽質(zhì)量（過熱值、干燥度、不凝氣體）、產(chǎn)品的特性（微生物的耐熱性與其所處的環(huán)境相關(guān)）等對(duì)于**效果的均有影響，同時(shí)，物理檢測(cè)基于前面所述的理論模型進(jìn)行預(yù)測(cè)的，實(shí)際狀況與理論模型不一定完全契合。因此，要驗(yàn)證**工藝，還需要用生物指示劑進(jìn)行考察，以確保物理殺滅效果（用FPHY）和生物殺滅效果（FBIO）具有一致性。這便是生物指示劑的選擇基礎(chǔ)。
四、生物指示劑的選擇-物理殺滅和生物殺滅的關(guān)系
選擇生物指示劑的選擇的主要依據(jù)是證明FPHY和FBIO具有一致性，即物理殺滅效果能夠?qū)嶋H殺滅相應(yīng)的生物指示劑。實(shí)際操作過程時(shí)，我們通常會(huì)選擇合適的生物指示劑，經(jīng)過**工藝**后進(jìn)行培養(yǎng)，如果全部呈陰性，那么我們判定**工藝符合預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)。
假定某一**工藝，其物理殺滅效果（FPHY）為F0值不低于12分鐘，理論來說，為證明一致性，所使用FBIO也應(yīng)為12分鐘，這樣才能證明兩者是一致的。假定所選擇的生物指示劑的D121℃為2分鐘，數(shù)量為106，則其殺滅所需要的時(shí)間理論上為：
FBIO= D121℃×(lgN0-lgN) = 12分鐘
看上去，F(xiàn)PHY和FBIO的時(shí)間剛好相當(dāng)，可選擇該生物指示劑進(jìn)行**的驗(yàn)證。然而，在介紹無菌保證水平的時(shí)候我們知道，微生物存活是一個(gè)概率問題。在這個(gè)案例中，當(dāng)FBIO為12分鐘時(shí)，**后的污染菌數(shù)量NFF為：
lgNF =lgN0–t/DT = 6–12/2 = 0，則 NF=1
也就是說，產(chǎn)品中依然有菌，生物指示劑**后培養(yǎng)時(shí)很大概率呈陽性。那么，問題來了，生物指示劑要如何選擇，才能證明FPHYHY與FBIO是一致的？根據(jù)EP9.0的要求，在進(jìn)行**工藝驗(yàn)證時(shí)，驗(yàn)證時(shí)時(shí)所選擇的**時(shí)間（tvl），應(yīng)將生物指示劑殺滅到10-1到10-3的水平，即
以上述生物指示劑為例，為驗(yàn)證FPHYY和FBIO是一致的，選擇的FPHY應(yīng)將生物指示劑**后的數(shù)量NF下降至-1至-3個(gè)log值（原來下降至0個(gè)log值），即：
即：2×(6+1) ≤tvl≤2×(6+3)
即：14≤tvl≤18 （分鐘）
而PDA則建議將生物指示劑殺滅到10-2的水平。（備注：將生物指示劑殺滅到102所需要的時(shí)間，即**結(jié)束后，生物指示劑全部呈陽性的時(shí)間，為生物指示劑的存活時(shí)間，survival time；將生物指示劑殺滅到10-4所需要的時(shí)間，也即生物指示劑**后全部呈陰性的時(shí)間，為生物指示劑的殺滅時(shí)間, kill time）。如果驗(yàn)證時(shí)，選擇的**時(shí)間tvl大于kill time，則無法證明FPHY和FBIO具有一致性。這時(shí)，我們可以選擇減少**時(shí)間（如半循環(huán)），或降低**溫度（這時(shí)需要知道生物指示劑在實(shí)際**條件下的Z值）來進(jìn)行**工藝的驗(yàn)證，當(dāng)然也可以選擇合適的生物指示劑，使得該生物指示劑的survival time和kill time滿足**參數(shù)的要求。
總結(jié)：本文介紹了**的原理、**的動(dòng)力學(xué)、**參數(shù)和**工藝的選擇，在此基礎(chǔ)之上，介紹了如何選擇合適的生物指示劑，以驗(yàn)證物理殺滅和生物殺滅的一致性。下一部分，我們會(huì)根據(jù)此理論基礎(chǔ)，介紹生物指示劑的種類、選擇、使用和質(zhì)量控制。